[molekulare Ernährungsphysiologie] Übung

출처 : https://www.reddit.com/r/labrats/comments/4v24mj/can_someone_explain_the_difference_between/

https://m.blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=hafs_snu&logNo=220855450875&proxyReferer=https%3A%2F%2Fwww.google.de%2F

- homolog : 동족체, 주기율표에서 같은 족에 속함, 또는 상동기관 (기원동일, 형태나 발생에서 유사성). 진화 과정에서 유효한 관계가 있는 유전자들이나 단백질

a gene related to a second gene by descent from a common ancestral DNA sequence

- ortholog : genes in  different speices that evoloved from a common ancestral gene by speciation

wenn ihr gemeinsamer Urahn ein Artbildungsereignis durchlaufen hat.

- paralog : genes related by duplication within a genome, wenn ihr gemeinsames Vorläufergen eine Genverdopplung durchlaufen hat

 gene duplication : 말그대로 한번 더 재조합해서 일부 구간이 동일 유전자로 2배가 되는 것. Mutant 임니다, 즉 DNA Frequenze 영향을 줌, PCR 의 Polymerase 가 하는 일이 이거다. 

- r Vorläufer : precursor,  전구체, 선행하는 물질

- The Expect value (E) is a parameter that describes the number of hits one can "expect" to see by chance when searching a database of a particular size. It decreases exponentially as the Score (S) of the match increases. Essentially, the E value describes the random background noise.

* 전사는 메티오닌에서 시작하나?항상?

- promoter : wo regulierte Expression eines Gens ermöglicht.

식물 유전자의 프로모터는 호르몬 농도, 외부 환경 스트레스, 영양 상태 등에 반응하여 유전자 발현의 특이성을 부여하는 DNA 서열을 가지고 있다. 이러한 반응 요소(responsive element)

- intron : 비발현부위. 의미없는 부위며 반대는 엑손. 진핵세포에 있고 단백질 만들 때에는 관여하지 않으며 transcription 과정서 잘려져 나감

- mRNA : 짧은 시간동안 존재. 전사과정에서 편집 번역을 담당. DNA 로부터 3 BasenSequenzen (Nucleotid) 으로 이뤄진 코돈 (유전암호 단위)  을 부여하며 이걸 리보솜으로 운반. 1코돈은 1개의 아미노산을 결정하며 리보솜에서는 tRNA 가 이걸 읽어들인다.

전사의 시작은 RNA Polymerase 가 mRNA에 필요한 DNA 유전자를 복사하여 생성기키면서 발동. 

- cDNA : complementary DNA 상보적, 즉 상호보완적 DNA. RNA polymerase (RNApol, RNAP), 이 만든 mRNA 에 의하 생성된 DNA. 이걸로 마이크로어레이를 해서 세포내 특정 유전자 발현 정도르 연구할 수 있음.

- PCR : 원리

- reporter gene : DNA의 존재 유무나 프로모터에 연결되어 발현 확인을 하게 해주는 tag gene. 예시는 Luciferase (발현하는 세포가 빛을 내도록 함), Galactosidase(역시 색을 띔), GFP(맨날보는 그거).  특정 프로모터 활성 분석에 사용도 가능 (특정 유전자 대신), 

- auxotrophy : 최소배지에서 생육못하고 둘 이상의 영양소를 생육에 필요로 하는 현상. 유전학 실험에 쓰일 수 있음 two yeast hybrid analyse

- Ansatz : approach

 neue Ansatz für Genanalyse ist...

- langwierig -,

- ovule : 

- cut and paste : 

- reversion of mutation by excision of transposon

- miRNA, : 보통 RNA 보다 좀 작다 (수천 nucleotid 대신 20-25개). 유전자 발현에 영향을 주는 친구인데 mRNA 와 complementary 결합해서 regulatary factor 로서 활약. 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는 비발현 RNA 분자라고 말할 수 있다.

- helicase : 나선효소, DNA 복제할 때 이중나선을 푸는데 필요한 효소. 

질문

- RT PCR, 

- electrophoresis 할때 쓰이는 물질과 그 녀석의 역할은? SDS

- 여기서 중요한 개념인 isoelectronic 이란?

- 어떤 모티피카찌온이 electronic Ladung을 바꾸나? phosphorilierung

- 2d gel electrophoresis : 결과는 어떻게 나타나는가. 이미지 설명

- hydrophobic protein 은 막단백질일텐데 

Übung

01_Gene Discovery

1. finding gene, Analysing gene, 그다음은 Protein(Localising, anlysing, interaction), 또는 membrane, 

2. 예시: 칼슘체널을 책임지는 유전자?

 - zwei möglichkeit : 1. plant sequence 2. sequence from other organism (mouse, human...)

 - 이를 위해선 vorläufe Organismus 를 살핀다. Verwandtschaftsgrad suchen

3. 보통 인간의 해석된 유전정보를 가져다가 많이 쓴다. 싱기방기

 - 그래도 최소한 대상 플랜트의 gene must be sequenced...

 - 재기된 질문 : 단백질을 regulate 하는 sequence 의 경우 식물과 동물이 좀 다를 수 있다 왜냐면 similar function amino acid 들로 이뤄진 다른 단백질이 담당할 수도 있으니까!

 - 그래서 원하는 형질을 gene sequence 로 찾기보다 protein 를 찾는게 나음 : Blast에서 이 정보는 Amino acid 약자로 나열되어 있음

4. 만약 단백질 정보는 없고 gene sequence 만 있음 우야지? * 이 때도 그래도 다른 생물의 단백질 시퀀스는 알고 있어야함

 - protein query - translated nucleotide search 

 - 어떤 문제? Sequence 는 그냥 나열되어있을 뿐. 어디서 읽기를 시작해야 하나??

 - 17 페이지 : 6가지 가능성이 있고 이 모든게 고려되어야한다. 그래서 검색하면 진짜 여러 가능성을 보여줌 

19. 만약 아무것도 gene sequence 모르면?

 - 코드로 보는게 아니라 function 으로 찾아야 한다. sequence 가 아니다

 - Complementation screen : gene 은 다른 생물 (yeast) 에 집어넣어서 단백질을 발현시키고 관찰

 - mRNA 는 옮기기에는 너무 empfindlich 해서 cDNA 를 이용한다는 것 같음

22. RT-PCR : Reverse Transcrption - Polymerase Chain Reaction

 - cDNA 를 어케 늘리지? PCR 원리 설명 

23. PCR 과정과 참여 요소 설명할 줄 알아야.

 - polymerase 만드는 녀석은 고온 적응된 녀석?

27. cDNA library : 

28. 왼쪽 방법으로 하면 결국 의미가 없다. 쓸때없는 부분이 섞여서 뭐가뭔지 몰라버렷

29. Yeast complementation screen : 이스트 테스트의 요지는? 무슨 메커니즘을 이용하나여?

30. Uracil 이건 reporter gene 과 연계해서 생각해볼 수 있음 

33. 디엔에이 씨퀀씽은 다른 수업에서 다뤄질거임

34. Reverse genetics : function of the gene(protein) in planta

 - Gene (protein) : unknown function -> Delete or overexpress gene -> phenotype 로 확인

37. Agrobacteria 의 번식 방식을 이용해서 식물 안에서 저걸 테스틔

39. Zellteilung - Versorgung  

43. tration thechiqu... langwirig? 한 과정. 전체 다 해서 거진 1년 걸린다.

 - Gerste 젱ㄹ 어렵고 ㅡ

44. 이 실험이 겨울에 학기 시작하는 것과 관련

45. Ovule :

46. T-DNA insertional mu

47. Insertion site Iedns

 : PCR 로 불려서 있는지 없는지 찾아보거나, 

48. 잘 들어갔나 확인하기 

 - 확인한 T-DNA 를 색ㅇ===='

49. 이러한 뮤턴트 뱅크가 있어서 후루룩 훓을 수 있단다.

50. Transposon : copy and paste

51. 이걸로 뮤턴트 만들 수도 있다. 쮸히퉁에서 많이 쓰유요

54. Decrease expression of gene : microRNA 이거 Phosphate 수업에서 잠시 다뤄졌다고.

57. miRNA 를 위용해 phytopathologie 에서도 응용하기도 한다, hex host hix silencing ?

 - ZNF, TALENs, CRISPR/Cas9 이러한 다른 genome editing 은 다른 수업에서 다뤄짐미다.

- transcription and translation : ein wesentlicher Teilprozess der Genexpression. dadurch wird 3 RNA (mRNA, tRNA, rRNA) hergestellt. DNA-Abschnitt dient als Vorlage(Tempate) zur Synthese von RNA. Translation wird als die Synthese von Proteinen bezeichnet. Mit transkribtierte mRNA ...

- amplificaiton of DNA in PCR

- housekeeping gene : 

- semiquantitative RT-PCR : 

- fluorsensieren : 발광하다

- fluorescence quenched by FRET : 끄다? 풀다?

- haften : adhere 붙이다, 접착하다

02_Gene Expression Analysis : mRNA 

2. cloned gene of interest?

6. housekeeping gene : 

7. problem : 열때문에 

8. 이 실험의 결과로는 A, B 가 구분이  잘안된다. A에는 

9. quantitative real time RE-PCR 

11. SYBR green fuorsces green : 디엔에이 염색하기! DNA dye

 - 실험실에서 일어 날 수 있는 이 테스트의 문제? Unreinigung, 우리가 원하는 곳 말고 엉뚱한데 primer 가 갖다붙거나 gelargert. 

unterschiedliche Schmelztemperatua 만약 온도가 너무 낮으면 이 primer 는... Specificity 도 중요한 요소.

14. realtime PCR 의 유의사항 : 결과적으로는 모든 polymer 는 sample 과 온도별 테스트가 전제되어야 한다. prerequisite

15. Realtime PCR with TaqMan probe : 이걸 통해 더 spezifischer 하게 만든다 그 전거보다.. 다만 단점은 비싸다구! 11번 방법은 primer가 전부 다 염색해버리기 때문에 특이성이 낮다고

16. quantification : 영역별로 나눠놓음. 많을수록 빨리 반응이 시작

18. gene expression level  다른 방법음? Promoter activity 프로모터 악티비텟!

20. reporter gene fusion : 예시가 GFP다!!! 이걸 만드는 과정에서 transform target plant 할때 아까 말한 agrobacterian 이 쓰인다

 - 즉, 프로모터의 엑티브 상태를 측정하는 것이다. 

23. GUS B-Galactosidase und B-Glucuronidase : 이것도 염색하는 물질

25. 성장에 따라 파래지는 것은 우리가 측정하고 싶은 DNA 가 발현된다는 거시다.

26. 3번째 방법 : Luciferlase protein from firefly 빛이 번쩍번쩍남. 프로모터에 붙이진 않고 프로모터를 달고있는 gene에 딱 바른다

33. promoter, transcription factor 데이터뱅크도 있다

34. 웨스턴블롯 - 프로틴, 노던블롯 - RNA, 서던블롯 - DNA, 

35. southern blot 과의 차이는 

36. 노던블롯을 하는 이유는 

38. in situ hybridisation : 식물의 조직 gebewe, 

40. 장난아님. in situ rt pcr. 

 - 기존 RT PCR 은 관찰하려면 기존의 위치정보를 잃어버리게 된다. 그걸 극복하고자 함. 

42. 마지막 세미나에서 봤던 것. 뿌리 내 중금속이었나..? 그거 움직임 관찰하던게 이거였음 in situ rt PCR

43. 한번에 여러 gene 동시에 expression evaluaiton

 - Macroarray : reverse Norhern blot, 근데 너무 손이 많이가고 그래서 이젠 더 안쓴다

46. 대신 microarray : 짧은 슬라이드에 뿅 하고 찍혀서 나옴. 색은 녹색, 붉은이 있고 둘이 겹치면 노란색. 검은건 아무것도 없음

- tedious :  지루한, 싫증나는

- collision : 충돌, Kollision, Stoß, 

- proteome : 단백체. PROTEin expressed by a genOME 의 합성어. 단백질로 발현되는 과정 전체에 관여하는 단백질의 총집합

- immunigold labelling : immunogold Localization

- wenn strahlt ,  dann leucht

- interagieren 인터아기-어런

03_Protein analysis

4. electrophoresis : 젤 사이를 단백질이 통과하게 만듬. 움직임 포텐셜은 전기장으로 만들고 통과하는 젤 사이의 공극을 통해 분리

 - 이 기술의 약자 PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis. protein movement 관여 요소는 꽤 많다

 - arcylamide : 독성도 있고 여튼 좀 유명했던 물질. 

7. 사이즈별로 단백질 분리는 어케?

 - SDS : 아까 PAGE 시스템에서 단백질을 SDS 로 끓여서 풀어버림. 헉

 - 예시가 있어야 더 알아들을 듯...

10. 좋은 예시

11. 이제 단백질을 어떻게 visible하게 만들까?

12. silver스테이닝은 굉장히 sensitiv 함. 

13. 이 검은 선은 Rubisco (der häufigste Protein)

14. 스펙시픽 프로틴 뭘 검출할라고 한다? Antibody

18. 2개를 하는 이유는? 

20. 크기 외 단백질을 분리할 수 있는 parameter : elektrische Ladung... 즉 pH Werte 

 - 어떤 amino gruppe 를 갖고 있능가.

 - 이걸 하기 위해선 isoelecric field 를 만들어야 한다. imobilized

28. identify and detect unknown protein : interest cut off*

29. zerlegt und definiert. Gel 안에서 trypsin 어쩌고 하고 extract 해서 Peptie masses determination (Massspectrometrie 로 슉슉) 

30. 측정방법 설명 : 식물에 대해서 힘든 점은 마지막에 펩티드 사이즈가 데이터베이스에 있는 게놈 정보와 비교하여 결과를 얻는데 많은 crop 이 아직 시퀀스가 다 안됐다구.

31. 다른 방법 ESI-MS : verdampfen. 아까 레이져와 비교할 때 장점은 HPLC 같은 liquid separation techniques 과 바로 연계가 가능하다는 점.

33. 이건 크기만 말해주고 프로틴의 Sequence 에 대한 정보는 엄음

34. collision. 

35. 앞의 과정을 계속 반복하면 쌓인 데이터로 아주 그냥 단백질 믹스쳐 한큐 분석이 가능하다구. 근데 온갖 연구 그룹 다같이 모여서 합동연구를 해야함. 빡시다

38. 프로틴 분석 툴 4가지 정리

39. subcellular localization analysis 을 위해선 원심분리하고 각 내용물을 밀도차? 로 나누고 분리된 녀석을 enzyme activity 측정해서 역할 등을 연구한다. anhand ihrer Dichte, 

43. 예시: 사카로제 gradient 를 따라 분류하고 그걸 western blot 으로 양을 디텍팅. 

44. 많은 단백질 localization을 위해선 다른 단백질 구분을 위해 마커를 단다. 그리고 그 마커달린녀석들을 IB 분리, 

45. 이 방법은 상대적으로 불확실 할 수 있다...

47. 안티바디이용. immunostaining : 2번째 안티바디는 1번째와 다른 곳에 . 1번째 마커는 골지에, 2번째는 그 . 안티바디는 각각다른 동물로부터 추출하는 듯. 

49. 더 해상도를 높이기 위해 금 입자를 이용한다. 금 입자에 프로틴을 붙여서 이녀석을 안티바디에 붙여서 해상력 호흐

52. immunocytochemistry 더 높은 해상력을 제공하지만 아무래도 Antibody 에 대한 이해도와 기술이 필요. höhe Ansprüche an Antikörper

53. leuchtet 

54. Ausgangsorganismus : Aequorea victoria 라는 해파리에서 추출한 물질이다ㅏ. 신기하게 생물체 안에서 알아서 leuchtet

56. GFP 는  슈톡콜러? 이용해서 붙인다. Frame shift...  목표유전자를 변형해서 거기에 붙여서 나오게 하는것

59. 원래 골지에 있는 녀석. 

61. 그리고 GFP 는 색깔을 조심씩 바꿔줄 수 있다. 뮤테이션

62. 적녹색맹의 존재땜에 노란색 인거 아주 좋음

63. 관찰하려면 역시 또 fluorscence microscopy 필요하지여. spezifische Wellenlänge 를 Lichtquelle 이용 

 - first barrier filter 이용. 이거없이 일반적 white licht 는 리그닌 같은곳에서 왕반사

64. 가장 큰 문제는 빛이 blurred 한다는 것. 

 - 해결책 : 여러가지. 일단 하나는 집중된 빛으로 부분을 관찰하는 것. 레이저 confocal laser-scanning microscopy (CLSM) 이걸 fokusierte Anlegung 이라카네. 이걸로 한 Point (Punkt) 를 찍을 수 있다, 그리고 기존 conventional fluorescence microscopy 와 다른건 기존은 눈으로 봤다면 이건 detector를 거쳐야 함,

 - 이걸 반복하면 3차원 사진도 만들 수 있다. 문제는 여러번 찍는게 시간이 걸리는데 이 동안 fluorscense protein 이 변성 denaturation 된다는 것.

 

71. 실제 개별 프로틴을 살펴보입시다.

74. 어떻게 한 프로틴 내 아미노산들이 엮이고 구성되는지는 여러 측정, 실험기술을 엮어서 한다. 

75. two yeast hybrid (Y2H) system : 

 - transcription factor 를 recognition site 에 부착한다, 

 - bait vector, prey vector 를 high affinity protein interaction 갖추게 디자인한다

78. AKT1 : 칼륨 카날. central K uptake 근데 특정상황에서 regulate 된다. CBL 은 칼슘과 연관, CIPK 는 키레이스, 

79. 문제점 2가지가 있다!! : 이스트의 핵분열은 막에서 일어나는게 아님

 -최근에 발견된 한계. 그러니까 우리가 실험하고 싶은 펙터(단백질, 효소) 를 만들어낼 수 있는 유전자를 붙여서 만드는데 이스트 내에서는 핵막에 존재하는 단백질이나 핵막의 펙터가 있어야 발동하는 환경을 만들어줄 수 없다.?

80. 이걸 해소하기 위한게 ubiquitin 을 이용해서 막의 조건을 조성해주는 것

81. analysis in planta?

 - BiFC : 베타베론과 2 가지 GFP 는 서로 붙을 수 있다 

 - 근데 이걸로 하면 뭔가 다이나믹한 상황을 관찰하지에는 좀 부족하다는 듯

85. FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer: RFRE

- rot  energie armer , Eisen: höhe

 - violeete bescghrorrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrö                                                                                                             

- centrifugation : 원심분리 Zentrifugation / Zentrifugierung

- quenching : 담금질??? 또는 급랭

- tonoplast : 액포막.

- detergent ; Reinigungsmittel, Waschmittel, 세제

- protoplast : 원형질체. 세포벽을 인위적으로 제거한 세포. 터지기 쉽지만 외부로부터 DNA, 단백질 등을 도입시킬 수 있어서 연구용 좋음.

만드는 방법은 Pectinase, Cellulase 이용

- capacitor : Kontensator, 콘덴서를 의미하며 축전기를 의미. 내부에 전하를 갖고 있음

- oocyte : 난모세포. 난자의 근원이 되는 세포로 난소 내에서 분열 증식을 정지하고 성장기에 들어간 세포

04_Transporter interaction

6. legume root nodule

11. protoplast tpp

16. 2가지 가능성 vesicle : outside out, inside out, 

 - FCCP : Loch für proton. Proton channel, 

 - 어떤 Ca 트랜스포터가 atp 를 안쓰고 ...

23. abhängigkeit von Na+

 - 아주 전형적인 클래시컬한 실험이라네.

24. 이번엔 막 포텐셜 측정 : 이게 정확한 막 트랜스포트의 정보를 주지는 못한다. 

26. 여기서 widerstand : Bauteil, 즉 transporter, Capacity (Kontensator) : 막 그 자체. 건전지를 생각해보면 화학적 에너지를 가진 막들을 전해질 용액 사이에 담궈놔가 기본적으로 찌릿 빠워를 담아놓은것. 그러니까 막과 그 안과 밖, voltage source : 

U Spannung `= R Widerstand * A Stromfluss

27. R 의 변화는 기본적으로 Transporter 의 schließen / offen 이 영향, 

옴의 법칙을 이용해 볼트를 고정해놓고 현재의 전류를 측정함으로써 막 R 을 알아내고, 거이

28. 이걸 할 수 있을 정도로 큰 세포가 필요하다. 무슨 세포를 해야할 까? Xenopus oocytes

31. 무슨 문제가 있을까 이 테스트에는

 - 여튼 ㅎㅐ결책으로 

34. patch clamp technique

- 시작은 셀을 잡는걸로. 그리고 다양한 모드가 있다. 잡은거 사이로 fehler 가 있을수도 있으니까 높은전압

- outside out 하면 너무 작아서 카날이 한개만 들어있을지도, 

39. 앞의 멤브란 떼어서 실험한거와 비교하면 

 - single channel은 낮은 전압에도 반응이 있다.

 - 그러나 전체 셀로 하면 낮은 전압에서는 반응 자체가 없다. 

 - 38페이지의 체널이 하나씩 열리는 것과 비교하자면, 낮은 멤브란 슈파눙에서는 잘 안열리는데 높은 멤브란 슈파눙에서는 

 - 새로운 펙터 : 채널의 수, 그리고 열리는 성능 등이 추가된다구

41. 예시

43. 아주 훌륭한 interp 여튼 완전 물리화학적 method 와 완전 생물학적 뮤턴트 기술이 합친 좋은 사례

45. ER 처럼 패치클램프 테스트 못하는 경우에는 이렇게 새로 만드는 거다.

- r Überschuss : excess, overflow, surplus 과잉, 과도

- aequirin : 해파리 추출 형광단백질

- Fret : 두개의 형광물질이 가까운 거리에 있을 때 고영에 의해 에너지를 전달하는 현상, 즉 dependency on distance. CFP, YFP 이렇게 사용가능

05_Ions and metabolites in plants

2. 스트레스에 대한 칼슘 리엑션

5. farbstoff와 ca 의 상보작용인데 둘의 Verhältnis 로 

6. 인디케이터는 쌓여서 문제가 될 수 있는게 이 녀석이 카르복실그룹을 같고있어서

14. 에코린 Aequirin : 

20. 에코린 빛이 엄청 약한데 (한 유닛당 포톤 1개...) 이걸 Photomultiplier 이용해서 강화해서 봅니다

21. 이건 spatial 정보는 제공하지 않음으로,

23. 이것도 결국 다 장단이 있다

24. FRET assay : 이 반응 자체에는 Ca 이 전혀 참여하지 않는다 그러나 Calmodulin 의 등장이면 좀 다르다. 칼모둘린은 두 형광 단백질을 붙이는 역할인데 칼슘이 있어야 칼모듈린이 반응. 이걸 모티브로 칼슘 측정에 FRET 이 사용가능

33. 다른 원소 센서 : eCALwy sensor für Zn

36. Proton sensor : 

37. 다른 metabolite sensor ; Glutamat 센서

[시험준비 - 질문 리스트]

- Solute Transport in Plants - 

 1) Intro

4. How are those nutrient present in the soil?   5. What are the ion exchangers in the soil?

7. What about the anions?, other aninon?   10.