Sequencing 원리 - Sanger,

 

출처 : 

https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ

https://en.wikipedia.org/wiki/Dideoxynucleotide

https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=527203&ksr=1&FindText=sanger%20sequencing

https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=48822&ksr=1&FindText=sanger%20sequencing

 

 

 

[Sanger DNA Sequencing]

 1. Amplifying DNA : 이 단계에서 이미 target DNA 가 cut 된 상태인가?

 - 보통 plasmid vector 에 실은 상태에서 배양함으로써 증폭.

https://www.youtube.com/watch?v=ONGdehkB8jU

 

 2. Denaturation by heat until single stranded DNA

 - 이게 Templet strand

 3. Primer 가 5 end의 dNTP(deoxy Nucleoside TriPhosphate)를 붙일 site에 달라붙는다. complement하게.

 4.  the primed DNA는 dispersed equally among four reaction vessels. 

 5. 4개의 Vessel 에 DNA Polymerase 추가

 6. 4종류의 dNTP 추가

 7. chain termination : one type of ddNTP(Dideoxy-)를 each vessel 에 추가 : 디데옥시NTP는 hydroxyl gruoup 이 3' 에 부족 (OH 대신 H 붙어있음). 그래서 합성이 여기서 멈춰진다.

 - 여기에 Fluorescence tag 

 8. Gel-electrophoresis with polyacrylamid Gel : 사이즈에 따라 가벼운 순으로 + 극에 가깝게 정렬

 - Phosphate 의 O- 차이 덕에 정렬가능

 9. 결과 : A, T, G, C 각 Vessel 별 길이에 따라 나눠진 Gel Electrophoresis. 이걸 길이에 따라 정렬하고 베슬 별 Nucleotide 를 배열하면!! -> 원하던 시퀀스 순서(5' - 3') 대로 get

 * Sanger sequencing 에서 읽어낼 수 있는 base pair length는 무엇에 제한되는가? DNA Polymerase 수명으로 인한 PCR cycle 한계, gel-electrophoresis 의 resolution문제?

 * 최초 프라이머는 어떻게 디자인되는가? 생어에서 random primer는 쓸 수 없다! 왜냐면 여러군데서 polymerization이 시작되면 ddNTP 에 의한 구분이 유명무실해지기 때문. 

 - 보통 plasmid vector 등에 미지의 DNA 단편을 클로닝한 뒤 알고있는 영역 (Vector) 의 sequence 로 만들어진 Primer를 이용해 이 미지의 DNA를 시퀀싱. 

 - 그 외 Alternative : Pyrosequencing, 

 

[NGS Next Generation Sequencing]