embryo rescue, plasmid rescue

0. Embryo rescue

출처 : https://www.lifeasible.com/custom-solutions/plant/plant-breeding/embryo-rescue/

 - 매숙배 배양이라고 하는듯 : in vitro culture technique used to assist in the development of an immature or weak embryo into a viable plant.  used for producing interspecific and intergeneric hybrids, as well as progenies of incompatible crosses which lead to embryo abortion

 - 종간 또는 세대가 다른 하이브리드, 그리고 incompatible cross 에 한해 Embryo abortion이 일어나는걸 우회하는 기술. in vitro, 즉 시험관 내에서 미성숙된 녀석을 배양. 

 - 기존 씨앗에서는 배가 생성되지 못할 걸 적절한 medium에서 fertil plant로 자라날 수 있도록 하는 기술

출처 : Lifeasible 웹사이트

1. Transformation with bacteria

출처 : 다인바이오 주식회사 홈피

http://www.dynebio.co.kr/yc/bbs/board.php?bo_table=data1&wr_id=16&sst=wr_hit&sod=desc&sop=and&page=1

 -  Bacterial transformation

bacteria로 외부 DNA를 도입하는 과정. E. coli transformation.

E. coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데 일반적으로 두 가지 방법이 있다. host cell로 들어간 DNA는 ampicillin 내성 유전자 (beta lactamase를 coding하는 유전자)가 포함된 plasmid를 사용하여 ampicillin이 포함된 배지에서 선발하여 확인한다.

즉, 집어넣을 DNA는 우선 제한효소 등으로 쪼갠다음 그걸 옮겨줄 플라스미드에 싣는 것. 싣는 방법은 아래와 같이 쇼크를 줘서 세균이 타겟 DNA를 세포막 내로 집어넣게 하는 것. 

Bacterial transformation (CaCl2법, Heat-Shock method)

Electroporation

플라스미드에 제대로 실렸는지 확인하려면 마커가 필요한데 보통 antibiotic 마커를 이용. 플라스미드가 항생제 내성을 가진 유전자가 실린 애라서 우리 타겟 DNA 와 멀쩡하게 incuvating됐으면 항생제 처리에서 살아남는 걸로 잘 됐구나 하게 안다고. 

 - 식물로 외부 DNA의 형질전환 방법 : 고전적 방법은 Protoplast fusion

- 일시적인 형질전환(transient)

1) Agrobacterium-mediated transformation

2) Osmotic shock

Ex) polyethylene glycol (PEG)를 이용, 세포벽을 제거한 원형질체(protoplast)에 외부 DNA를 형질전환할 경우 사용

   Stable 형질전환: 염색체 DNA에 삽입된 세포의 새로운 개체로 증식

   형질전환 식물

식물 형질전환의 단계 : 즉, 타겟 DNA는 쪼개서 세균 플라스미드에 싣는다. 그리고 세균 증식해서 타겟을 왕 늘린다. 늘렸음 이걸 쪼개서 타겟 DNA만 빼내고 이걸 앞과 같이 T Plasmid에 싣는다. 즉, 앞서 세균은 원하는 DNA를 늘리는 PCR 같은 과정이다. 아그로 박테리아는 vir gene 과 T-DNA 이 두개가 주요 요소인데 vir은 1) T-DNA의 절단 2) single-strand로 이동 3) 식물 세포내에서 double strand로 복제 4) 식물 염색체 DNA에 삽입 하고 T-DNA는 우리가 원하는 DNA를 싣고 있는 부분이다. 옮겨진 T-DNA는 식물내 염색체에서 랜덤 site에 삽입된다!

- E. coli에서 binary vector를 증식해서 얻음

- 목적 유전자를 binary vector에 construction

- E. coli에 재조한 binary vector를 형질전환하여 증폭

- 증폭된 재조합 DNA를 분리하여 agrobacterium에 다시 형질전환

- 목적 유전자를 포함하고 있는 T-DNA부분은 식물의 염색체에 삽입됨.

- 외부 유전자가 도입된 cell을 증식하여 형질전환된 식물을 얻음

유전자 조작 및 식물 형질전환 도구로써의 Agrobacterium tumefaciens

- vir gene과 T-DNA 부분을 나누어서 plasmid로 조작이 가능함

- T-DNA가 식물 염색체로 옮겨지는데 LB(left border)와 RB(right border)

식물세포로 T-DNA의 전달

- T-DNA의 이동은 상처난 식물 부위에 Agrobacterium이 감염될 경우 일어남

- vir gene 산물의 역할

1) T-DNA의 절단 2) single-strand로 이동 3) 식물 세포내에서 double strand로 복제 4) 식물 염색체 DNA에 삽입

- T-DNA는 식물 염색체 DNA의 random site에 삽입됨.

 

식물 protoplast에 PEG법에 의한 외부 유전자 형질전환 및 발현

목적 유전자와 GEP fusion construct 제조 à E. coli를 통해 재조합 binary vector 다량 확보 à cellulase 처리를 통한 식물 protoplast 제조 à protoplast + construct à PEG 처리 à 형광현미경 또는 confocal microscope를 이용한 발현 여부 확인

 

2. Plasmid rescue

출처 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19377999

The pBluescript-containing RescueMu transposon can be readily recovered by a procedure called plasmid rescue

Plasmid rescue is a technique for recovering bacterial plasmids from transgenic eukaryotic genomic DNA

Ampicillin or carbenicillin was used for RescueMu transgene recovery.

Plasmid rescue is a technique for recovering bacterial plasmids from transgenic eukaryotic genomic DNA. Total maize DNA was first digested with restriction enzyme(s), ligated, and then transformed into E. coli cells. Colonies were recovered under selection against the antibiotic marker(s) in the transgene vector.

The flanking genomic sequences at RescueMu insertion sites were simultaneously captured and then sequenced using RescueMu-readout primers

출처 : https://link.springer.com/article/10.1007/BF02668346

T-DNA를 통해 트랜스폼된 식물은 이제 외부의 타겟 유전자를 갖고있다. 식물 내에서 잘 붙어있는지 어떤지 감염다음에는 간접적으로 밖에 모르겠지. 해당 유전자에 해당하는 treatment를 동반한 실험을 통해 확인이 되면 이제 이 유전자를 다시 isolation해야지! 확실해진거니까. 이 플라스미드 레스큐는 이렇게 들어간 유전자를 다시 분리하는 기술이다.

방법은 트랜스폼된 식물 DNA를 제한효소로 쪼갠다음 특정 항생제 (ampicillin) 에 내성가진 E-Coli 에 집어넣어 뿔린다고. 질문 : 쪼갠 녀석은 확실함????

왜 이짓을 하냐면 그래야 origin of replication을 다시 얻어내서 isolation에 쓸 수 있으니까. 이걸 plasmid with flanking sequence라는데 T DNA가 달라붙게 만드는 식물의 좌우 시퀀스를 보함해서 인듯. 이렇게 다시 떼어냈으면 클로닝을 통해 확실하게 원하는 plant gene 을 분리할 수 있다!!

The plasmids with flanking sequences can then serve as a starting point for cloning plant sequences that share homology to the DNA at the point of T-DNA insertion. -> 왜 homology라고 하는지? 정확히 그 부분이 추출되는 것 아닌가?