[molekulare Marker in der PFzüchtung]

- 수업은 2월 5일까지.

- 시험은mündlich oder schriftlich 인데 3월 말, 4월 말

 - 복습 : Markeranalyse를 위한 첫번째 단계는? DNA Isolierung (Bakterien, Hafen oder tierlisches, pflanzliches Gewebe 주로 junges Blattmaterial 로부터 시작한다) -> Zellwand를 기계적, 화학적으로 aufgeschlossen -> Rohextrakt -> Extraktionspuffer 추가 (65°) : 이 단계에서 각각의 단계마다 목적이 다르다 SDS, CTAB 등 -> PHenolextraktion : zur Abtrennung von Proteinen und Lipiden -> Ausfälling der Nukleinsäuren 이렇게 DNA를 Lösung 형태로 추출한다.

 - 복습 :  위의 단계는 보다시피 aufwendig. 그래서 여러개를 한큐에 할 수 있는게 Roboter (Extranktionsroboter BioSpirint 96 Qiagen) - Hochdurchsatz, gleichbleibende DNA-Qualität, DNA는 frei von Protein, Kontaminierung (깔끔하다 이말이지)

 - 복습 : BioSprint 96 과정 - 얼린걸 Metallbällchen 과 함께 mechanisch homogenisiert -> 간건 Lyse Puffer 에 가라앉힌다 -> MagAttract 서스펜슨? -> 마그네틱 Kügelchen이랑 갈아버리는데 자석인 이유는 negativ Ladung DNA를 + 자석으로 확 땡겨서 다른 단백질들과 분리하기 위해서임. 단백질, DNAse 등은 Salz 랑 같이 섞어서 이미 Denaturiert -> 

 - 복습 : manuel 과 로보터의 차이 - 로보터는 많은 샘플을 homogenische Qualität으로 빠르게 얻는다. 하지만 샘플당 DNA Inhalt 는 manuel 이 훨씬 높다.

 

- entscheidend : signifikant

- Reibungskraft : friction force, 마찰력

- Schmier : 

 

[2번째]

1. Markertechniken : 어떤 종류의 마커 기술이 있나요

 - RFLP : 1980년 개발. Restriction Fragment Length Polymorphism. DNA 를 여러 쉬니트로 끊어서 비교한 다음 같으면 놔두고 아님 더 쪼개서 반복.

 - RFLP Ablauf : DNA Isolation -> Restriktionsverdau -> Gel-Elektrophorese -> Southern-Hybridisierung (-Blot) -> Sonde

 1) Restriktionsenzyme : 1960년 즈음 개발된듯. 박테리아의 Schutzmechanismus vor artfremder DNA (Viren) 의 일환으로 다른 Phagen-DNA 를 자르는 효소. 유전 공학 (편집과 규명) 의 단초를 마련한 발견 중 하나. 특징은 spezifische Erkennungssequenzen (같은 부분을 쪼갠다) : 4-8 Basenpaare 를 끊음. 이게 길수록 더 특이적이고 seltner 하게 절단한다. 이 차이가 어떤 상황에서 우리가 어떤 제한 효소를 써야할지 구분케한다.

 - 5 Typen: 타입2가 bekannteste. 타입 1 과 타입 2의 차이는 구체적으로? 타입1은 특정 구간 (z.B AGCT) 을 erkennbar하다. 하지만 절단은 반드시 이 구간을 끊는게 아니라 랜덤하게 절단한다. 반면, 타입2는 Erkennungsteil (z.B 마찬가지로 AGCT) 를 인식한 다음 반드시 정해진 구간을 절단한다. 당연히 타입1은 이젠 안쓰겠지요. 타입3는 인식한 곳을 자르진 않고 다른 곳을 자르는데 (예를 들어 nach 100 Basenpaar vom Erkennungsteil) 반드시 이 곳을 자른다. 그 말은 타입 2, 3 은 결과가 reproduzierbar. 

https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1174460&cid=40942&categoryId=32822

 - Nomenklatur : EcoRI - 맨앞은 Gattung, 

 2) Restriktionsverdau : 요지는 제한효소로 쪼개서 프레그멘테로 만든 뒤 Polymorphism, 즉 다른 애들과 조금 달라서 표지로 쓸 수 있는 구간을 detektierbar. DNA + Enzym + Salze 한 후 Inkubation하는데 Enterobakterien은 meist bei 37° 에서 하지만 Sma1 (25°), Taq1 (65°) 같은 Ausnahme도 있다. 그리고 마지막엔 효소 Inaktivierung 하기 위해 EDTA넣는데 그 효과는 아래.

생화학이나 분자생물학에서는 DNA나 단백질에 관련된 실험을 할 때, 시료가 효소로 인하여 손상되는 것을 막기 위해 효소가 필요로 하는 금속 이온을 제거할 목적으로 EDTA를 사용한다.

 3) Gel-Elektrophorese

 - Agarose : hochreines Polymer. Rotalgen에서 얻어진건데 특정 온도 하에서 Vernetzung 해서 Poren을 만든다. 1975년 부터 개발된 꽤 오래된 기술이며 (lange etavilierte Technik) 이 Kondensation 에 따라 Poren이 작아진다. 

 - Agarose-Gelelektrophorese : Reibungskraft 로 인해 DNA Größe에 따라 분리된다. Auswertung은 염색시켜 그 빛을 읽어냄으로서 quantitative Messung이 가능하다. Farbstoff는 Ethidiumbromid (센시티브는 적당한데 toxisch. 더 안전한 건 아무래도 비싸다) 

 4) southern-Hybridisierung : 

 

* Hybridisierung, Hybridization : Hydrosis 를 위한 그 섞는 것과 다르다. DNA, RNA를 검출하기위해 komplementäre Sequenzen인 Sonden을 붙여서 측정하는 과정을 말한다. 이 Sonde는 radioaktiv oder chemisch markiert 되어있다. 이 Sonde는 최상의 경우 그 다음 페이지의 Pillen 사례처럼 확연하게 구분가능해야하고 

 - co-dominante Sonde : 이걸 이용하면 잡종이 잘되어 Heterozygote 인지 Homo인지 알 수 있게 함. 좋다 이말이야. 

2. Ursachen eines RFLP (- Polymorphismus) : 크게 3가지 가능성. 

 - Polymorpismus 자체는 뮤턴트, Genduplikation 등 다양한 원인이 있다. 우리가 말하고자 하는건 이 차이 (Polymorphismus)가 RFLP 를 통해 어떻게 지표로서 구분되는지 그 해석의 가능성을 말한다.

 - 첫번째는 원하는 구간을 잘 절단. 2개로 절단되었고 그 토막은 Gel-Elektrophoresis를 통해 크기에 따라 나눠진다. 두번째는 같은 DNA-Basenpaar 인데 중간의 Erkennungsteil 에 뮤턴트가 발생한 경우다. 그럼 이 도막은 큼지막하게 한줄로 잘릴 것이며 젤 결과는 첫번째 사례보다 훨씬 위쪽에 분리된다고. 마지막은 첫번째의 첫째 도막에 Genduplikation으로 인해 조금 길어지고 하지만 Erkennungsteil은 안잘려서 2 도막으로 분리되는 것. 겔에서는 2도막인데 첫번째 도막은 첫번째 사례보다 더 위쪽에 위치하겠지, Dupliziert 된 만큼 Basenpaar 길어졌을 테니까!

 - 이 3가지 사례는 서로 다른 지역에서 온 같은 종의 경우를 생각해볼 수 있다. 하나는 유럽, 하나는 아프리카, 나머진 남아메리카에서 왔으면 Erkennungsteil은 같을 정도로 비슷하지만 각자 다른 Evolution을 겪어서 조금씩 다르겠지요 -> Polymorphismus 의 발달.

3. Polymorphe Marker können dominant oder co-dominant sein : co-dominant는 dominant, rezessiv 의 힘이 비슷해서 같이 있는 경우 둘 다 발현된다. 혈액형 중 AB 형, 멍멍이 털색깔이 부모 섞인 색깔인거 같은거.

4. Vor- und Nachteile : 단점은 시간이랑 노동력을 갈아넣어야되고 상대적으로 DNA가 많이 필요하다. 즉, schwierige Automatisierbarkeit, 그리고 마커 읽는 과정때문에 nicht-radioaktive System에서는 시행하기 어렵

5. 그담 시간은 PCR-basierende Markertechniken

[다음 시간]

1. PCR

- 항상 Zyklus 단위로 진행된다. 주요 요소는 Mastermix (코펙터인 마그네슘 등), 온도 등

 - Marker 를 다룰때 : 리버스 게네틱. 우린 어디를 끊어야될지 알고 있는 상황이므로 (SNP) 그에 맞는 프라이머를 갖고 있다.

 - Denaturierung (여기서 kange Kette 가 두갈래로 확 갈라짐)- Anlagerung (Annealing) - Enlongation (Extension, 여기서 만들어진게 다시 1번에 사용된다)

 - 59. 3번째 사이클부터 사실상 우리가 원하는 Fragment 가 얻어진다. 우리가 얻고자 하는 부분만 특정 프라이머를 통해 얻어낸다. 다른 전체 Kette도 사이클에따라 늘어나지만 프라이머에 의해 복사되는 건 아니기에 원하는 dNA 만 빠른 속도로 더 많이 얻어진다. - 저 스페인 그룹에서 만든 영상이 좋았음

 - 60. 왼쪽의 프레그멘트 수는 우리가 원하는 이상적인 상황에 가깝다

62. Ausgangs-DNA : 기본적으론 이미 Isolisiert 된 상태. 일단은 너무 높은 EDTA 가 있음 안된다, 

 - 문제점 중요! : Repetitive Sequenz : Bindung der Primer verindern, GC-Reische Sequenze : 3-fache Wasserstoffbrückebindung 너무 stabil해서 분리가 ㄴ잘 안되는 듯.

64. Thermostabile DNA-Polymerase  : 핵심 요소

 - Taq-Polymerase : 열에 잘 견디는 Thermus aquaticus 에서 얻어진 DNA-Polymerase. 즉 그 태그랑은 상관이 없다.

 - Pfu-Polymerase : aus Pyrococcus furiosus, 이것도 Thermostabil, mit Korrekturlesefunktion (komplitär 하지 않으면 프레그먼트를 다시 체크하고 수리하는 기능인듯. 어째서?)

66. PCR-Primer : Sense(forward 5-3), Antisense (reverse)

 - Bindungspezifität : 15-40 Nukleotide, Formeln에 연관된 요소는 

 - 67. 최상의 프라이머 조건? gleiche SchmelzT, ansgewogener GC- und AT-Gehalt (디네츄레이션이 너무 오래 안걸리기 위해서 등), Sequenz nur einmal im Ausgangsmaterial?, keine Komplimentäre Sequenz (프라이머안에 ATATATAT 이런 komplimentär 하는 부분이 있으면, 지들끼리 붙어서 Hairpin 이 되거나 Dimere 될 수 도 있으니까), rein (keine Kontamination mit Fremd DNA), 

 - Primer 디자인을 위한 소프트웨어가 있단다

69. dNTP, MG2+ : dNTP 는 재료. 항상 im Überfluss 하게 존재해야한다, synthetisierende Produkt가 얼마나 길든 간에!

70. Überprüfung der PCR im Agarosegel : unspezifisch 했거나, Farbstoff 넣는거 까뭇거나, DNA 농도, 

72. Parameter für die Optimiereung einer PCR 

 - T, ..

74. notwendige Kontrollen für PCR : 3가지 콘트롤이 있다. negativ (아무것도 없는거), positiv (Ziel DNA가 들어있는 상황), Wiederholung, 

* 예전에 할레 캄푸스에서 다른 곳에 있던 렙을 여기로 옮겼다. 같은 기구에 같은 조건이었는데도 예전 메뉴얼로 했을 때 제대로 작동안했다고. 뭐 물때문일수도 있고 여튼 그래서 다시 메뉴얼을 작성해야했다고.

75. Markertechniken : RFLP

 - STS : PCR 기반. Sequence Tagged Site

 - 2가지 식물을 비교한다. 이처럼 헤테로 구분에 사용가능

77. STS Marker : heutzutage in PFforschung unbedeutend, 1989

 - 씨퀀스 정보가 필요하고(왼쪽, 오른쪽 뭘 읽을지 알아야되니까), Polymorphigrad가 낮고, Längenunterschiede im Gel 구분하기 힘들어! - 그래서 다른 알고 있는 마커들의 정보를 기반으로 이놈들 간 Kopplung을 비교할 때 쓸 수 있다네. 

 - 장점은 co-dominant(양쪽 영향을 다 받은것도 나타낼 수 있다), gut reproduzierbar, nur wenig DNA wird nenötigt (이건 모든 PCR기반 기술의 Gemeinsamkeit)

78. SSR : Simple Sequence Repeat : Mikrosatelliten, 1989, 꽤 오래된 기술

 - Hintergrund : 반복해서 나타나는 Sequence(Tandem repeat, Strand slippage??) 구간의 존재가 아이디어의 시초. DNA Replikation 에 의해 발생하는 오류를 늘이거나 줄이거나??? 여튼 남미의 식물은 이 구간이 20개, 유럽은 10개 이런식으로 진화적 배경을 예상할 수 있는 단서가 된다. Punktmutation 보다 훨씬 높은 가능성으로 Mutationsrate 를 가진 구간. 

 - Hintergrund 80 - Minisatelliten : RFLP처럼 어떤 변화가 생겨서 PCR 에서 계속 합성이 안되는듯. 

 - 81. Polyacro amid Gel : 아래에서 보이듯 Basenlänge가 같다! 그래서 기존의 Agarosegel은 안되고 더 섬세하게 구분가능한 겔이 낫다.

 - 83. Beispiel - Kopplung einer Krankheit mit SSR Marker : jeweils selben Primer 사용해서 조사한다! 그 덕에 M´´ 딱 발견

 - 85. Kartierung eines Mikrosatelliten in einer Gersten F1-PP : 여기서 보듯, 비교되는 건 2 Allele (A, a) 이다. 막 전체 씨퀀스를 다 발라서 뜯어보고 그런 개념은 아니다. 그 덕에 

* 98프로의 Wildgerste 는 Wintergerste. 즉, Sommergerste는 다소 특이한 녀석

 - 86. Entwicklung von SSR-Markern : 발견된 SSR 정보를 어떻게 DNA bibliothek 에 넣고 그걸 기반으로 이 녀석에 맞는 PCR Primer를 만들까 에 대한 과정이다.

 - 88. 장단점 : 역시 씨퀀스 정보가 필요, 프라이머 만들기 빡시고 분석을 위한 Bande가 많지않다. 장점은 좀 더 많은데, 특히 hoher Polymorphiegrad(뮤턴트가 더 많으니까??)!, 

 

 - E.Coli 가 디엔에이 폴리머라제로 사용되는 이유?

 - 지금까지 씨퀀스는 이론만 꾸준히 다루는데 차라리 실제 씨퀀스 예시를 먼저 보여주면서 이래서 이런 메토데가 적용됐다는 식의 접근이 훨 직관적일 것 같다. 

 

[SNP?]

1. Pyrosequencing : 비싸서 지금은 안 쓴다는 듯.

 - 6 Schritten : PCR해서 PCR Platte 생성 – 이걸 씨퀀싱플라테에 옮김 – Denaturierung der DNA

 - Annealing – 씨퀀싱 – 평가

 1) PCR : 비오틴으로 표지된다

 2) PCR Platte zur Sequenzierungsplatte : 아가로제같은 Streptavidin으로 이 DNA를 immobilisieren 하는데 이 녀석은 비오딘과 매우 높은 Affinität을 가진다. 그런다음 VPT (VacuumPrepTool) 로 이 ㅈ녀석들 포집 (이게 꽤 멋진 아이디어라카는데)

 3) Denaturierung der DNA : 디네쳐레이션 뢰중을 넣어서 이 도펠 슈트랭에를 한줄로 쪼갠다. 그리고 이 과정에서 비오틴 달고있지 않은 부분은 entfernt된다. 

 - Vorbereitung : 엔자임, dNTP (A,C,G,T)

https://m.blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=gamble0726&logNo=140065580826&proxyReferer=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F

 - Enzyme : E coli DNA Pol 1, Saccharomyces cerevisiae ATP sulfurylase, Luciferase, Apyrase(liguid phase pyrosequencing 가능케함)?, 

 - 구체적 과정 : einzelnes dNTP (예를들어 A) 를 넣으면 목표 시퀀스에 따라 만들어지겠지. 그다음 다른 dNTP넣고 하면서 SNP 관찰. DNA-Polymerase는 여기서 이 dNTP가 디엔에스 슈트랭 만드는데 도움!, pyrophosphat (PPi, 이녀석이 있으면 Sulfurylase의 존재와 함께 APS 와 결합해서 ATP를 만드는 역할. 이 ATP는 루시퍼라제에서 빛을 내는데 에너지로 쓰임) - 이걸로 피크를 확인해서 측정

 - wie lange dauert : 96개 샘플이 한번에 처리되는게 아니라 nacheinander abgearbeitet되서 시간은 좀 걸린다 이말이야. 4.1 s * 10 bp Sequenz * 96 Proben = 66min 

 - Temperatur : 이상적으론 Raumtemperatur. Tag Polymerase (opt bei 72도) 를 사용안하고 Luciferase 는 28도 이상에선 instabil 이고 해서 룸템퍼레쳐

 - Detektion : 호모와 헤테로 구분은 어떤 시퀀스가 가 아니고 이 씨퀀스의 시그널 크기를 비교해서 알아낸다.

 - Probleme : 아래 보이듯 기기에 Residue 가 남아서 지저분하게 낮은 피크들이 쌓이는걸 Hintergrund 문제라 하는듯, 그리고 비오틴은 비싸다 이말이야

 - Apyrase : unutilized dNTP를 계속 분해하는 녀석이다. 즉, 백그라운드 노이즈 레벨을 줄이는 역할을 한다. 다른 nucleotide-degrading enzyme과 비교했을 때 뭐 좀 더 안정적이라는 듯

 - 보여준 Biotage의 영상이 아주 설명이 잘되있다우

2. Real-time PCR basierende Detektion (am Bsp. von TaqMan 택맨) : 

 - Voraussetzung : einzelsträngige DNA Probe mit Reporter, Quencher, 

3. Detektion von SNPs mittels KASP : 다른 시스템들은 hohe Durchsatz (한번에 1000개 이상 sNP 분석 등) 을 가지면 일반 실험실에서 못쓸 정도의 가격대이지만 이 KASP 는 상대적으로 싸면서 Durchsatz도 나쁘지 않아 일반 실험실에서도 사용가능하다. 

 - 왜 이게 그렇게 toll? : bei heterozygoten können beide Primer binden, 시그널을 발생하는 단계가 2번인듯. Denaturierung될 때 한번, 그리고 다시 komplimentär 할 때 또 한번. 

 - Auswertung des Fluoreszenzsignal : 여기서 연두색이 heterozygote라고. 둘 다 적당히 존재해서 

 - 이것도 비디오가 좋다. 이것도 비디오 좋다! LGC 에서 제공하는 10분짜리 영상.